発癌予防剤
【課題】 安全で有効な発癌予防剤を提供する。
【解決手段】 本発明の発癌予防剤は、ドルスマンニンＡ、キサントアンゲロールＩ、キサントアンゲロールＪからなる群から選ばれた少なくとも１種のカルコン類化合物、キサントトキシン、イソピンピネリン、オスセノールからなる群から選ばれた少なくとも１種のクマリン類化合物、イソババチン、マンデレアフラバノンＢ、８−ゲラニルナリンゲニンからなる群から選ばれた少なくとも１種のフラバノン類化合物、及び、ジアセチレン類化合物である（１１Ｓ，１６Ｒ）−ジヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１７−ジエン−１２，１４−ジイン−１−イルアセタートのうちの少なくとも１種の化合物を含有する。
【解決手段】 本発明の発癌予防剤は、ドルスマンニンＡ、キサントアンゲロールＩ、キサントアンゲロールＪからなる群から選ばれた少なくとも１種のカルコン類化合物、キサントトキシン、イソピンピネリン、オスセノールからなる群から選ばれた少なくとも１種のクマリン類化合物、イソババチン、マンデレアフラバノンＢ、８−ゲラニルナリンゲニンからなる群から選ばれた少なくとも１種のフラバノン類化合物、及び、ジアセチレン類化合物である（１１Ｓ，１６Ｒ）−ジヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１７−ジエン−１２，１４−ジイン−１−イルアセタートのうちの少なくとも１種の化合物を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発癌予防剤に関し、特にカルコン類化合物、クマリン類化合物、フラバノン類化合物及びジアセチレン類化合物の少なくとも１種を含有する発癌予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、セリ科多年生植物であるアシタバからの抽出物が発癌予防作用を有することは知られている（特許文献１参照）。また、発癌予防剤として有効なカルコン類化合物が存在することは公知である（非特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００３−１５５２４８号公報
【非特許文献１】ｏｋｕｙａｍａら，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，５７巻，２４２頁，１９９１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１は、具体的に発癌予防に関して十分な効果を有する特定の成分を開示するものではない。一方、発癌予防の大きなニーズに鑑みて、安全で有効な発癌予防剤が得られないものかとの期待は大きい。
本発明は、安全で有効な発癌予防剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、上記の課題を解決するものとして、アシタバ成分を有効成分とする新しい発癌予防剤を提供する。すなわち本発明は、アシタバ成分に発癌予防作用を見出した点に重要な意味を有するものであり、本発明の請求項１による発癌予防剤は、ドルスマンニンＡ（以下、本発明において「化合物１」と称することも有る）、キサントアンゲロールＩ（以下、本発明において「化合物２」と称することも有る）、キサントアンゲロールＪ（以下、本発明において「化合物３」と称することも有る）からなる群から選ばれた少なくとも１種のカルコン類化合物、キサントトキシン（以下、本発明において「化合物４」と称することも有る）、イソピンピネリン（以下、本発明において「化合物５」と称することも有る）、オスセノール（以下、本発明において「化合物６」と称することも有る）からなる群から選ばれた少なくとも１種のクマリン類化合物、イソババチン（以下、本発明において「化合物７」と称することも有る）、マンデレアフラバノンＢ（以下、本発明において「化合物８」と称することも有る）、８−ゲラニルナリンゲニン（以下、本発明において「化合物９」と称することも有る）、からなる群から選ばれた少なくとも１種のフラバノン類化合物、及び、ジアセチレン類化合物である（１１Ｓ，１６Ｒ）−ジヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１７−ジエン−１２，１４−ジイン−１−イルアセタート（以下、本発明において「化合物１０」と称することも有る）のうちの少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする。
【０００５】
上述のような化合物であれば、発癌予防効果に優れ、かつ、安全性も高い。
なお、上述した本発明の化合物には、医学的に使用され薬理学的に許容される各化合物の塩も含むものであるもの。このような塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩等を挙げることができる。
【０００６】
また、上述した請求項１に記載の本発明の化合物が溶剤和物（例えば水和物）を形成する場合は、これらもすべて本発明に含まれる。例えば、本発明の化合物が、大気中に放置されたり、または再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水が付着したり、水和物を形成する場合がある。本発明にはこのような溶剤和物も含まれる。
さらに、請求項１に記載の本発明の化合物は、それぞれいくつかの不斉炭素原子を有しており、このため、種々の光学異性体が存在する。本発明においては、特に記述しない限り、ラセミ化合物を含むこれらの異性体及びこれらの異性体の混合物をもすべて含むものである。
本発明の請求項２による発癌予防剤は、請求項１において、前記化合物は、アシタバを処理して得られることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、安全かつ発癌予防効果に優れた発癌予防剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
次に、実施例により本発明を具体的に説明する。すなわち、アシタバ浸出液からの前記化合物１〜１０の単離、当該化合物１〜１０の構造解析及び同定、ならびに本発明に係る発癌予防剤の効果確認試験について説明する。
［アシタバ浸出液からの化合物１〜１０の単離について］
まず、アシタバ浸出液（茎部切断面からの浸出液、３００ｇ）を減圧乾燥し、乾燥物（２２．３ｇ）を得た。これをｎ−ヘキサン／メタノール／水（９５：９５：１０）にて分層し、ｎ−ヘキサン画分（０．５０４ｇ）を得た。メタノール／水画分を更に酢酸エチル／水（１：１）で分層し、酢酸エチル画分（１５．３ｇ）を得た。更に上記残部である水画分についてｎ−ブタノール／水（１：１）で分層し、ｎ−ブタノール画分（０．１８４ｇ）、水画分（５．７９ｇ）を得た。
【０００９】
上記のようにして得られた酢酸エチル画分はシリカゲル（５００ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル［９５：５（１．５Ｌ）、８：２（２．０Ｌ）、１：１（４．０Ｌ）、０：１（５．０Ｌ）］、酢酸エチル／メタノール［４：１（２．０Ｌ）、１：１（３．５Ｌ）、０：１（０．５Ｌ）］を順に用いて分画し、１２画分（Ｆｒ．Ａ〜Ｌ：Ｆｒ．Ａ（１８１．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ（８１９．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ（９４４．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ（７８１７．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ（３５７６．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ（５２９．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｇ（１７０．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ（１７９．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｉ（５４．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｊ（７９．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｋ（７６．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｌ（３３．１ｍｇ））に分画した。
【００１０】
Ｆｒ．Ｄについて、更にシリカゲル（５００ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル［０：１（０．５Ｌ）、９：１（１．５Ｌ）、８５：１５（５．０Ｌ）、８：２（１．０Ｌ）、７５：２５（０．５Ｌ）、７：３（３．０Ｌ）、６：４（０．５Ｌ）、１：１（１．０Ｌ）、４：６（０．５Ｌ）、３：７（０．５Ｌ）、２：８（０．５Ｌ）、１：９（０．５Ｌ）、０：１（０．５Ｌ）］、酢酸エチル／メタノール［７：３（１．５Ｌ）、１：１（０．５Ｌ）、３：７（０．５Ｌ）、０：１（０．５Ｌ）］を順に用いて分画し、１３画分（Ｆｒ．Ｄ１〜Ｄ１３：Ｆｒ．Ｄ１（１４．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ２（３．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ３（２４．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ４（２３．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ５（１３８．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ６（１２５１．０ｍｇ）Ｆｒ．Ｄ７（１５３３．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ８（７５４．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９（６７９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１０（１６６３．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１１（９０．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１２（１１９．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１３（２３０．９ｍｇ））を得た。
【００１１】
Ｆｒ．Ｄ５はオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ（粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ；溶離液：メタノール／水／酢酸＝７５：２５：１；流速３．０ｍＬ／分）を行ない、化合物８（４．４ｍｇ；保持時間１５．２分）を単離した。
Ｆｒ．Ｄ９はＯＤＳ（１０ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、メタノール／水［投入順に７：３（１．３Ｌ）、１：０（０．４Ｌ）］を用いて分画し、４分画（Ｆｒ．Ｄ９ａ〜Ｄ９ｄ：Ｆｒ．Ｄ９ａ（１８３．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９ｂ（３９３．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９ｃ（２４．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９ｄ（３４．１ｍｇ））を得た。
【００１２】
このＦｒ．Ｄ９ｂはＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝８０：２０：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物２（３．４ｍｇ；保持時間１８．４分）、及び化合物３（１．８ｍｇ；保持時間２０．０分）、化合物９（３．６ｍｇ；保持時間３１．０分）を単離した。
【００１３】
Ｆｒ．ＥはＯＤＳ（１２０ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、メタノール／水［投入順に７：３（３．０Ｌ）、８：２（０．９Ｌ）、１：０（０．４Ｌ）］を用いて分画し、９分画（Ｆｒ．Ｅ１〜Ｅ９：Ｆｒ．Ｅ１（１１０．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ２（１００８．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ３（３２０．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ４（１２５．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ５（９０．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ６（６２．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ７（５２．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ８（１４１７．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ９（４４．７ｍｇ））を得た。
【００１４】
このＦｒ．Ｅ１はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：ＥＲＣ−ＯＤＳ−２５３２（横浜理化株式会社製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝６５：３５：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物４（２．７ｍｇ；保持時間７．６分）、及び化合物６（２．１ｍｇ；保持時間１４．８分）を単離した。
【００１５】
また、Ｆｒ．Ｅ４はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：ＥＲＣ−ＯＤＳ−２５３２（横浜理化株式会社製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝６５：３５：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物５（１．６ｍｇ；保持時間１０．８分）、及び化合物１０（２２．０ｍｇ；保持時間５１．６分）を単離した。
【００１６】
Ｆｒ．ＦはＯＤＳ（３０ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、メタノール／水［投入順に６：４（０．４Ｌ）、７：３（０．３Ｌ）、８：２（０．８Ｌ）、９：１（０．３Ｌ）、１：０（０．４Ｌ）］、酢酸エチル（０．４Ｌ）を用いて分画し、１０分画（Ｆｒ．Ｆ１〜Ｆ９：Ｆｒ．Ｆ１（８０．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ２（５４．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ３（７１．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ４（３１．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ５（４５．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ６（１７．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ７（４７．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ８（３２．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ９（２．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ１０（１０．２ｍｇ））を得た。
【００１７】
このＦｒ．Ｆ３はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝６５：３５：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物７（８．９ｍｇ；保持時間１９．６分）を単離した。
またＦｒ．Ｆ４はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝８０：２０：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物１（２．４ｍｇ；保持時間３１．２分）を単離した。
【００１８】
なお、アシタバの浸出液を調製する際の溶剤としては、水、アルコール類（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等）、脂肪酸エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ハロゲン化炭化水素類（クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン等）、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエン等）、脂肪族炭化水素類（ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等）等の溶媒の一種又は二種以上の混合溶媒が使用できる。
【００１９】
また、抽出方法は、上記方法に限定されず、水溶性又は高極性溶媒から徐々に低極性溶媒に抽出する過程を経ることなく、アシタバ浸出液をヘキサン等の低極性溶媒で直接抽出してもよい。
また、溶剤に浸すアシタバの部位は、特に限定されず、茎、葉及び根等のいずれの部位でもよい。
【００２０】
［化合物１〜１０の構造解析及び同定について］
上記の化合物１０種（化合物１〜１０）について、構造解析及び同定を行なったので、その結果を説明する。
化合物１〜１０の構造解析はＭＳ、ＩＲ、ＵＶ、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、２次元ＮＭＲである相関分光法（1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ）、異種核多量子コヒーレンス法（ＨＭＱＣ）、異種核遠隔多量子相関法（ＨＭＢＣ）、及び、核オーバーハウザー交換分光法（ＮＯＥＳＹ）を用いて行なった。この構造解析による化合物１〜１０の構造を図１に示す。
【００２１】
化合物２、３はこれまで文献記載の無い新規化合物であった。新規化合物２、３の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータをＨＭＢＣデータとともに表１、２に示した。また、図２に、新規化合物２、３のＮＯＥＳＹスペクトル法にて得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を立体構造式とともに両方の矢印で示した。
【００２２】
他の既知化合物の構造は、対応する化合物との種々のスペクトルデータの文献値（化合物１：Ｎｇａｄｊｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８巻、３４９頁、１９９８年；化合物４：Ｍａｓｕｄａら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻、１３頁、１９９８年；化合物５：Ｆｕｒｕｙａら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、１５巻、１３６２頁、１９６７年；化合物６：Ｍｕｒｒａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７巻、１２４７頁、１９７１年；化合物７：Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、２６巻、３８６３頁、１９７８年；化合物８：Ｒａｏら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６巻、１２７１頁、１９９７年；化合物９：Ｓｈｉｒａｔａｋｉら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、３３巻、４４４頁、１９８５年；化合物１０：Ｌｉｕら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２１１頁、１９９８年）との比較により確認した。但し、これらの化合物の発癌予防効果については知られていない。
【００２３】
新規化合物２、３の諸性質及びスペクトルデータを次に示す。
（１）キサントアンゲロールＩ（２′，３′−［２−メチル−２−（４−メチル−３−ペンテニル）ピラノ］−４，４−ジハイドロキシカルコン）（化合物２）：
黄色結晶．融点：１０６〜１０９℃．比旋光度［α］25D：８．００（濃度ｃ＝０．１％、溶媒：メタノール）．ＵＶ（溶媒：メタノール）λmax（単位：ｎｍ）：２０６、３５０．ＩＲ νmax（単位：ｃｍ-1）：３２６７、２９７１、２９３０（Ａｒ−Ｏ）、１６３９（Ｃ＝Ｏ）、１５８８、１５１２（芳香環由来）、１４４１、１３３４、１２８７、１２３３、１１６７、１０７２、８３２、８１１．
ＥＩ−Ｍｓ ｍ／ｚ（％）：３９２（７０）［Ｍ+］１２６９（８５）、１４９（１００）
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：３９２．１９８８（理論値Ｃ25Ｈ28Ｏ4［Ｍ+］、３９２．１９８７）
化合物２の13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＢＣのデータは表１に示した。
化合物２の13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：メタノール−ｄ4）
【００２４】
【表１】
【００２５】
なお、括弧内の数値は結合定数Ｊ値（ヘルツ）である。
（２）キサントアンゲロールＪ（２′，４，４′−トリヒドロキシ−３′−（３−ハイドロキシ−３，７−ジメチル−２−オクタエニル）カルコン）（化合物３）：
黄色結晶．融点：１２０〜１２３℃．比旋光度［α］25D：６．０（濃度＝０．１％、溶媒：メタノール）．ＵＶ（溶媒：メタノール）λmax（単位：ｎｍ）：２０６、３６８．ＩＲ νmax（単位：ｃｍ-1）：３３６９、２９６９、２９２８（Ａｒ−Ｏ）、１６０５（Ｃ＝Ｏ）、１５６２、１５１２（芳香環由来）、１４９１、１４４２、１３７０、１２１８、１２９２、１２３６、１１６８、１１０７、８３２、７９９．
ＥＩ−Ｍｓｍ／ｚ（％）：４１０（１１）、３９２９（４２）、２６９（５０）、２０３（３６）、１４９（１００）、１２０（３４）．
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：４１０．２０９６（理論値Ｃ25Ｈ30Ｏ5［Ｍ＋］、４１０．２０９３）．
化合物３の13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＢＣはデータを表２に示した。
化合物３の13Ｃ−ＮＭＲ（１２、５ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：アセトン−ｄ6）
【００２６】
【表２】
【００２７】
なお、括弧内の数値は結合定数Ｊ値（ヘルツ）である。
以下には新規化合物２、３の構造決定について述べる。
化合物２は、高分解能ＥＩ−ＭＳ（［Ｍ+］ｍ／ｚ：３９２．１９８７）より分子式Ｃ25Ｈ28Ｏ4を持つことが示された。ＩＲスペクトルは水酸基、カルボニル基、芳香環の存在を示した。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（δ（ｐｐｍ）、ＣＤ3ＯＤ）は６．８０（２Ｈ、ｄ）、７．４７（２Ｈ、ｄ）よりパラ位に置換基を持つベンゼンプロトンのシグナルを示し、また、６．４０（１Ｈ、ｄ）、７．４４（１Ｈ、ｄ）に互いにオルト位に位置する２個のベンゼンプロトンに帰属されるシグナルを示した。このことから４、２′、３′、４′位に置換基を持つカルコン骨格をもつ化合物であることが示唆された。さらに１．４４（ｓ）、１．６０（ｓ）、１、６７（２Ｈ、ｍ）、２．１２（２Ｈ、ｄｄ）、５．０３（１Ｈ、ｔ）よりジメチルアリル基の存在が示唆された。以上のデータに加え1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータのドルスマニンＡ（Ｎｇａｄｉｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８巻、３４９頁、１９９８年）との比較により２′、３′位にピラン環が有る事が明らかになった。この構造の正しいことは1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及び、ＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００２８】
化合物３は高分解能ＥＩ−ＭＳ（［Ｍ+］ｍ／ｚ：４１０．２０９６）より分子式Ｃ25Ｈ30Ｏ5を持つことが示された。ＩＲスペクトルは水酸基、カルボニル基、芳香環の存在を示した。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（δ（ｐｐｍ）、アセトン−ｄ6）は６．８７（２Ｈ、ｄ）、７．６７（２Ｈ、ｄ）よりパラ位に置換基を持つベンゼンプロトンのシグナルを示し、また、６．４５（１Ｈ、ｄ）、７．９１（１Ｈ、ｄ）に互いにオルト位に位置する２個のベンゼンプロトンに帰属されるシグナルを示した。このことから４、２′、３′、４′位に置換基を持つカルコン骨格をもつ化合物であることが示唆された。さらに１．１９（ｓ）、１．５０（２Ｈ、ｍ）、１．５７（ｓ）、１．６１（ｓ）、１．６５（２Ｈ、ｍ）、２．０８（２Ｈ、ｍ）、２．７１（２Ｈ、ｍ）、５．１０（１Ｈ、ｔｔ）より水酸基を持つゲラニル基の存在が示唆される。以上のデータに加え1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータのキサントアンゲロール（Ｂａｂａら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻、３９０７頁、１９９０年）との比較により３′位にゲラニル基が置換されていることが明らかになった。この構造の正しいことは1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及び、ＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００２９】
なお、化合物１〜１０は、上記のような化学構造式で示されるものであれば、アシタバから抽出した天然化合物に限られず、天然化合物を修飾し、或いは、化学合成することにより得るものであってもよい。
上述した本発明の化合物１〜１０は、単独であるいは混合して用いることができる。
また、化合物１〜１０は、適当な医薬用の担体又は希釈剤と組み合わせて医薬とすることができ、通常の如何なる方法によっても製剤化でき、経口又は非経口投与するための固体、半固体又は液体の剤形に処方することができる。処方にあたっては、他の医薬活性成分との配合剤としてもよい。
【００３０】
例えば、日本薬局方に記載されている各種製剤、即ち、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、乾燥エキス剤、トローチ剤等の内用固形製剤、流エキス剤、エリキシル剤、酒精剤、シロップ剤、リモナーデ剤等の内容液剤、チンキ剤、リニメント剤、ローション剤等の外用液剤、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤等の外用剤などに製剤化できる。また、投与可能であるならば、吸入剤、エアゾール剤、注射剤、点眼剤、座剤等にも用途に応じて製剤化してもよい。
【００３１】
経口投与においては、成人に対し体重１ｋｇ当り０．５〜５００ｍｇ／日の範囲で投与するのが好ましい。
また、本発明に係る化合物１〜１０は発癌予防の薬剤として使用するだけでなく、種々の飲食品に添加し、発癌予防に有効な機能性飲食品を製造するのにも有用なものである。このような機能性飲食品の形態の例としては、顆粒、錠菓、ゼリー、飴、飲料などが挙げられる。また、本発明に係る化合物１〜１０は、人間の食べる食品としてだけでなく、ペット、家畜、競技用動物などの人間以外の動物の飼料に添加して利用され得る。
【００３２】
［発癌予防効果の確認試験について］
次に、本発明の効果を確認するために行なった試験について説明する。
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）活性化抑制試験）
ＥＢＶ活性化抑制試験は、抗発癌プロモーター探索の一次スクリーニング法として知られた試験であり、迅速、かつ定量性に優れ、加えて、微量活性成分の検出が可能な点で優れた試験である。
【００３３】
まず、試験の手順について図１のスキームを参照しながら説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０巻、３０９頁、１９８８年）準拠している。
（１）１×１０6／ｍＬのＲａｊｉ（ラジ）細胞に、発癌プロモーターとして、２０ｎｇ／ｍＬの濃度の１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を３２ｐｍｏ１加え、さらにＴＰＡの活性発現のために相乗効果として働くｎ−酪酸を加えた。
（２）そこに、水、エタノール、又はジメチルスルホキシドに溶解した所定量の被験物質を添加して、３７℃で４８時間培養した。
（３）培養終了後、上咽頭癌患者の血清（ＴＰＡにより活性化された細胞由来の抗体を含む）を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ早期抗原の発現を検出した。
【００３４】
上記の手順にしたがって試験を行なった後、ＴＰＡのみを加えた群（コントロール）のＥＢＶ早期抗原の発現率を１００％として、被験物質添加物のＥＢＶ早期抗原の発現率を求め、次式（１）により被験物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を算出した。
ＥＢＶ早期抗原の発現阻害率
＝１００−被験物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率（％）…式（１）
【００３５】
検定は、前述のようにしてアシタバ浸出液から得られた化合物１〜１０を被験物質とし、各被験物質を種々の濃度（被験物質／ＴＰＡのモル比）に調製して行った。この検定の結果を表３に示す。また、参照化合物としてクルクミンを被験物質に用いた。
１０種のカルコン類、クマリン類、フラバノン類、及びジアセチレン類化合物のＥＢＶ発現阻害率（％）
【００３６】
【表３】
【００３７】
なお、被験物質の濃度が１０００倍モル濃度の欄の括弧内の数値は、ラジ細胞の生存率（％）を示す。この数値が高いほうが正常細胞に対する悪影響が小さい、すなわち安全性が高いといえる。表３に示されるように、アシタバ浸出液の成分は阻害率の高い化合物を有している。発癌予防効果があると知られている参照化合物のクルクミン（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５９巻、１３５頁、２０００年）と比較すると、化合物２、３、６〜９は１０００倍モル濃度ではクルクミンと同様に１００％の値を示し、１０倍モル濃度ではクルクミンよりも強い９〜１２％の値を示した。このことから抗発癌プロモーター活性に優れていることが確認された。更に、これらは本検定において高いラジ細胞生存率を示したことから、高い安全性を持つ発癌予防剤として期待できる。
【００３８】
さらに、化合物１〜１０をＮＯ障害に対する抑制試験を行い、活性を示したので説明する。
（ＮＯ障害に対する抑制試験）
（±）−（Ｅ）−４−メチル−２−［（Ｅ）−ハイドロキシイミノ］−５−ニトロ−６−メトキシ−３−ヘキセナミド（ＮＯＲ１）処理による細胞形態変化抑制試験は発癌イニシエターの一次スクリーニング法として知られた試験である。ＮＯはガス状のフリーラジカルであり、その過剰産生が慢性化すると、胃がんや大腸がんの危険性が高まるといわれている。このことから、ＮＯの過剰生産を抑制することが発癌予防に有効であるといえる。この試験は迅速、かつ微量活性成分の検出が可能な点で優れた試験である。
【００３９】
試験方法について説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０５巻、９頁、２００４年）に準拠している。
（１）イーグルの最小必要培地より得た５×１０5／ｍＬのヒト正常肝由来細胞を３日間培養する。
（２）そこに被験物質を加え、その１分後にＮＯドナーであるＮＯＲ１を加えＣＯ2インキュベーターで培養する。
（３）細胞の形態変化を光学顕微鏡にて測定する（２５０以上の形態変化を示した細胞数を測定する。）。
【００４０】
上記の手順に従って試験を行なった後、被験物質を加えない群をコントロールとし、次式によりＮＯ障害に対する抑制率を算出した。
ＮＯ障害に対する抑制率
＝ＮＯＲ１のみで形態変化した細胞（％）／ＮＯＲ１と被験物質を加えたときの形態変化した細胞（％）…式（２）
前述のようにアシタバ浸出液から得られた化合物１〜１０を被験物質として行った検定の結果を表４に示す。なお、参照化合物として、発癌予防効果があることが知られているクルクミン（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５９巻、１３５頁、２０００年）と、ＮＯスカベンジャーである２−（４−カルボキシフェニル）−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル３−オキシドナトリウム塩（カルボキシ−ＰＴＩＯ）を被験物質に用いた結果も示した。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４に示すように、化合物２、３、６、８、９は参照化合物と同程度、又はそれ以上の活性を示した。このことから抗発癌イニシエーター活性を有することが確認された。これらの化合物は発癌予防剤として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る化合物１〜１０の化学構造式を示す図である。
【図２】本発明に係る化合物２、３のＮＯＥＳＹスペクトル法により得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を説明する図である。
【図３】ＥＢＶ活性化抑制試験の手順を説明する図である。
【図４】ＮＯ障害に対する抑制試験の手順を説明する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は発癌予防剤に関し、特にカルコン類化合物、クマリン類化合物、フラバノン類化合物及びジアセチレン類化合物の少なくとも１種を含有する発癌予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、セリ科多年生植物であるアシタバからの抽出物が発癌予防作用を有することは知られている（特許文献１参照）。また、発癌予防剤として有効なカルコン類化合物が存在することは公知である（非特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００３−１５５２４８号公報
【非特許文献１】ｏｋｕｙａｍａら，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，５７巻，２４２頁，１９９１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１は、具体的に発癌予防に関して十分な効果を有する特定の成分を開示するものではない。一方、発癌予防の大きなニーズに鑑みて、安全で有効な発癌予防剤が得られないものかとの期待は大きい。
本発明は、安全で有効な発癌予防剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、上記の課題を解決するものとして、アシタバ成分を有効成分とする新しい発癌予防剤を提供する。すなわち本発明は、アシタバ成分に発癌予防作用を見出した点に重要な意味を有するものであり、本発明の請求項１による発癌予防剤は、ドルスマンニンＡ（以下、本発明において「化合物１」と称することも有る）、キサントアンゲロールＩ（以下、本発明において「化合物２」と称することも有る）、キサントアンゲロールＪ（以下、本発明において「化合物３」と称することも有る）からなる群から選ばれた少なくとも１種のカルコン類化合物、キサントトキシン（以下、本発明において「化合物４」と称することも有る）、イソピンピネリン（以下、本発明において「化合物５」と称することも有る）、オスセノール（以下、本発明において「化合物６」と称することも有る）からなる群から選ばれた少なくとも１種のクマリン類化合物、イソババチン（以下、本発明において「化合物７」と称することも有る）、マンデレアフラバノンＢ（以下、本発明において「化合物８」と称することも有る）、８−ゲラニルナリンゲニン（以下、本発明において「化合物９」と称することも有る）、からなる群から選ばれた少なくとも１種のフラバノン類化合物、及び、ジアセチレン類化合物である（１１Ｓ，１６Ｒ）−ジヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１７−ジエン−１２，１４−ジイン−１−イルアセタート（以下、本発明において「化合物１０」と称することも有る）のうちの少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする。
【０００５】
上述のような化合物であれば、発癌予防効果に優れ、かつ、安全性も高い。
なお、上述した本発明の化合物には、医学的に使用され薬理学的に許容される各化合物の塩も含むものであるもの。このような塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩等を挙げることができる。
【０００６】
また、上述した請求項１に記載の本発明の化合物が溶剤和物（例えば水和物）を形成する場合は、これらもすべて本発明に含まれる。例えば、本発明の化合物が、大気中に放置されたり、または再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水が付着したり、水和物を形成する場合がある。本発明にはこのような溶剤和物も含まれる。
さらに、請求項１に記載の本発明の化合物は、それぞれいくつかの不斉炭素原子を有しており、このため、種々の光学異性体が存在する。本発明においては、特に記述しない限り、ラセミ化合物を含むこれらの異性体及びこれらの異性体の混合物をもすべて含むものである。
本発明の請求項２による発癌予防剤は、請求項１において、前記化合物は、アシタバを処理して得られることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、安全かつ発癌予防効果に優れた発癌予防剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
次に、実施例により本発明を具体的に説明する。すなわち、アシタバ浸出液からの前記化合物１〜１０の単離、当該化合物１〜１０の構造解析及び同定、ならびに本発明に係る発癌予防剤の効果確認試験について説明する。
［アシタバ浸出液からの化合物１〜１０の単離について］
まず、アシタバ浸出液（茎部切断面からの浸出液、３００ｇ）を減圧乾燥し、乾燥物（２２．３ｇ）を得た。これをｎ−ヘキサン／メタノール／水（９５：９５：１０）にて分層し、ｎ−ヘキサン画分（０．５０４ｇ）を得た。メタノール／水画分を更に酢酸エチル／水（１：１）で分層し、酢酸エチル画分（１５．３ｇ）を得た。更に上記残部である水画分についてｎ−ブタノール／水（１：１）で分層し、ｎ−ブタノール画分（０．１８４ｇ）、水画分（５．７９ｇ）を得た。
【０００９】
上記のようにして得られた酢酸エチル画分はシリカゲル（５００ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル［９５：５（１．５Ｌ）、８：２（２．０Ｌ）、１：１（４．０Ｌ）、０：１（５．０Ｌ）］、酢酸エチル／メタノール［４：１（２．０Ｌ）、１：１（３．５Ｌ）、０：１（０．５Ｌ）］を順に用いて分画し、１２画分（Ｆｒ．Ａ〜Ｌ：Ｆｒ．Ａ（１８１．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ（８１９．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ（９４４．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ（７８１７．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ（３５７６．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ（５２９．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｇ（１７０．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ（１７９．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｉ（５４．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｊ（７９．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｋ（７６．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｌ（３３．１ｍｇ））に分画した。
【００１０】
Ｆｒ．Ｄについて、更にシリカゲル（５００ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル［０：１（０．５Ｌ）、９：１（１．５Ｌ）、８５：１５（５．０Ｌ）、８：２（１．０Ｌ）、７５：２５（０．５Ｌ）、７：３（３．０Ｌ）、６：４（０．５Ｌ）、１：１（１．０Ｌ）、４：６（０．５Ｌ）、３：７（０．５Ｌ）、２：８（０．５Ｌ）、１：９（０．５Ｌ）、０：１（０．５Ｌ）］、酢酸エチル／メタノール［７：３（１．５Ｌ）、１：１（０．５Ｌ）、３：７（０．５Ｌ）、０：１（０．５Ｌ）］を順に用いて分画し、１３画分（Ｆｒ．Ｄ１〜Ｄ１３：Ｆｒ．Ｄ１（１４．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ２（３．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ３（２４．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ４（２３．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ５（１３８．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ６（１２５１．０ｍｇ）Ｆｒ．Ｄ７（１５３３．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ８（７５４．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９（６７９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１０（１６６３．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１１（９０．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１２（１１９．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ１３（２３０．９ｍｇ））を得た。
【００１１】
Ｆｒ．Ｄ５はオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ（粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ；溶離液：メタノール／水／酢酸＝７５：２５：１；流速３．０ｍＬ／分）を行ない、化合物８（４．４ｍｇ；保持時間１５．２分）を単離した。
Ｆｒ．Ｄ９はＯＤＳ（１０ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、メタノール／水［投入順に７：３（１．３Ｌ）、１：０（０．４Ｌ）］を用いて分画し、４分画（Ｆｒ．Ｄ９ａ〜Ｄ９ｄ：Ｆｒ．Ｄ９ａ（１８３．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９ｂ（３９３．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９ｃ（２４．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｄ９ｄ（３４．１ｍｇ））を得た。
【００１２】
このＦｒ．Ｄ９ｂはＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝８０：２０：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物２（３．４ｍｇ；保持時間１８．４分）、及び化合物３（１．８ｍｇ；保持時間２０．０分）、化合物９（３．６ｍｇ；保持時間３１．０分）を単離した。
【００１３】
Ｆｒ．ＥはＯＤＳ（１２０ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、メタノール／水［投入順に７：３（３．０Ｌ）、８：２（０．９Ｌ）、１：０（０．４Ｌ）］を用いて分画し、９分画（Ｆｒ．Ｅ１〜Ｅ９：Ｆｒ．Ｅ１（１１０．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ２（１００８．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ３（３２０．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ４（１２５．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ５（９０．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ６（６２．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ７（５２．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ８（１４１７．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｅ９（４４．７ｍｇ））を得た。
【００１４】
このＦｒ．Ｅ１はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：ＥＲＣ−ＯＤＳ−２５３２（横浜理化株式会社製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝６５：３５：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物４（２．７ｍｇ；保持時間７．６分）、及び化合物６（２．１ｍｇ；保持時間１４．８分）を単離した。
【００１５】
また、Ｆｒ．Ｅ４はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：ＥＲＣ−ＯＤＳ−２５３２（横浜理化株式会社製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝６５：３５：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物５（１．６ｍｇ；保持時間１０．８分）、及び化合物１０（２２．０ｍｇ；保持時間５１．６分）を単離した。
【００１６】
Ｆｒ．ＦはＯＤＳ（３０ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行なった。溶出液として、メタノール／水［投入順に６：４（０．４Ｌ）、７：３（０．３Ｌ）、８：２（０．８Ｌ）、９：１（０．３Ｌ）、１：０（０．４Ｌ）］、酢酸エチル（０．４Ｌ）を用いて分画し、１０分画（Ｆｒ．Ｆ１〜Ｆ９：Ｆｒ．Ｆ１（８０．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ２（５４．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ３（７１．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ４（３１．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ５（４５．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ６（１７．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ７（４７．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ８（３２．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ９（２．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｆ１０（１０．２ｍｇ））を得た。
【００１７】
このＦｒ．Ｆ３はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝６５：３５：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物７（８．９ｍｇ；保持時間１９．６分）を単離した。
またＦｒ．Ｆ４はＯＤＳカラムによる分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、粒子径５μｍ、長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）；溶離液：メタノール／水／酢酸＝８０：２０：１；流速２．０ｍＬ／分）を行ない、化合物１（２．４ｍｇ；保持時間３１．２分）を単離した。
【００１８】
なお、アシタバの浸出液を調製する際の溶剤としては、水、アルコール類（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等）、脂肪酸エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ハロゲン化炭化水素類（クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン等）、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエン等）、脂肪族炭化水素類（ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等）等の溶媒の一種又は二種以上の混合溶媒が使用できる。
【００１９】
また、抽出方法は、上記方法に限定されず、水溶性又は高極性溶媒から徐々に低極性溶媒に抽出する過程を経ることなく、アシタバ浸出液をヘキサン等の低極性溶媒で直接抽出してもよい。
また、溶剤に浸すアシタバの部位は、特に限定されず、茎、葉及び根等のいずれの部位でもよい。
【００２０】
［化合物１〜１０の構造解析及び同定について］
上記の化合物１０種（化合物１〜１０）について、構造解析及び同定を行なったので、その結果を説明する。
化合物１〜１０の構造解析はＭＳ、ＩＲ、ＵＶ、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、２次元ＮＭＲである相関分光法（1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ）、異種核多量子コヒーレンス法（ＨＭＱＣ）、異種核遠隔多量子相関法（ＨＭＢＣ）、及び、核オーバーハウザー交換分光法（ＮＯＥＳＹ）を用いて行なった。この構造解析による化合物１〜１０の構造を図１に示す。
【００２１】
化合物２、３はこれまで文献記載の無い新規化合物であった。新規化合物２、３の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータをＨＭＢＣデータとともに表１、２に示した。また、図２に、新規化合物２、３のＮＯＥＳＹスペクトル法にて得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を立体構造式とともに両方の矢印で示した。
【００２２】
他の既知化合物の構造は、対応する化合物との種々のスペクトルデータの文献値（化合物１：Ｎｇａｄｊｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８巻、３４９頁、１９９８年；化合物４：Ｍａｓｕｄａら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻、１３頁、１９９８年；化合物５：Ｆｕｒｕｙａら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、１５巻、１３６２頁、１９６７年；化合物６：Ｍｕｒｒａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７巻、１２４７頁、１９７１年；化合物７：Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、２６巻、３８６３頁、１９７８年；化合物８：Ｒａｏら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６巻、１２７１頁、１９９７年；化合物９：Ｓｈｉｒａｔａｋｉら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、３３巻、４４４頁、１９８５年；化合物１０：Ｌｉｕら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻、２１１頁、１９９８年）との比較により確認した。但し、これらの化合物の発癌予防効果については知られていない。
【００２３】
新規化合物２、３の諸性質及びスペクトルデータを次に示す。
（１）キサントアンゲロールＩ（２′，３′−［２−メチル−２−（４−メチル−３−ペンテニル）ピラノ］−４，４−ジハイドロキシカルコン）（化合物２）：
黄色結晶．融点：１０６〜１０９℃．比旋光度［α］25D：８．００（濃度ｃ＝０．１％、溶媒：メタノール）．ＵＶ（溶媒：メタノール）λmax（単位：ｎｍ）：２０６、３５０．ＩＲ νmax（単位：ｃｍ-1）：３２６７、２９７１、２９３０（Ａｒ−Ｏ）、１６３９（Ｃ＝Ｏ）、１５８８、１５１２（芳香環由来）、１４４１、１３３４、１２８７、１２３３、１１６７、１０７２、８３２、８１１．
ＥＩ−Ｍｓ ｍ／ｚ（％）：３９２（７０）［Ｍ+］１２６９（８５）、１４９（１００）
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：３９２．１９８８（理論値Ｃ25Ｈ28Ｏ4［Ｍ+］、３９２．１９８７）
化合物２の13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＢＣのデータは表１に示した。
化合物２の13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：メタノール−ｄ4）
【００２４】
【表１】
【００２５】
なお、括弧内の数値は結合定数Ｊ値（ヘルツ）である。
（２）キサントアンゲロールＪ（２′，４，４′−トリヒドロキシ−３′−（３−ハイドロキシ−３，７−ジメチル−２−オクタエニル）カルコン）（化合物３）：
黄色結晶．融点：１２０〜１２３℃．比旋光度［α］25D：６．０（濃度＝０．１％、溶媒：メタノール）．ＵＶ（溶媒：メタノール）λmax（単位：ｎｍ）：２０６、３６８．ＩＲ νmax（単位：ｃｍ-1）：３３６９、２９６９、２９２８（Ａｒ−Ｏ）、１６０５（Ｃ＝Ｏ）、１５６２、１５１２（芳香環由来）、１４９１、１４４２、１３７０、１２１８、１２９２、１２３６、１１６８、１１０７、８３２、７９９．
ＥＩ−Ｍｓｍ／ｚ（％）：４１０（１１）、３９２９（４２）、２６９（５０）、２０３（３６）、１４９（１００）、１２０（３４）．
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：４１０．２０９６（理論値Ｃ25Ｈ30Ｏ5［Ｍ＋］、４１０．２０９３）．
化合物３の13Ｃ−ＮＭＲ、1Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＢＣはデータを表２に示した。
化合物３の13Ｃ−ＮＭＲ（１２、５ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：アセトン−ｄ6）
【００２６】
【表２】
【００２７】
なお、括弧内の数値は結合定数Ｊ値（ヘルツ）である。
以下には新規化合物２、３の構造決定について述べる。
化合物２は、高分解能ＥＩ−ＭＳ（［Ｍ+］ｍ／ｚ：３９２．１９８７）より分子式Ｃ25Ｈ28Ｏ4を持つことが示された。ＩＲスペクトルは水酸基、カルボニル基、芳香環の存在を示した。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（δ（ｐｐｍ）、ＣＤ3ＯＤ）は６．８０（２Ｈ、ｄ）、７．４７（２Ｈ、ｄ）よりパラ位に置換基を持つベンゼンプロトンのシグナルを示し、また、６．４０（１Ｈ、ｄ）、７．４４（１Ｈ、ｄ）に互いにオルト位に位置する２個のベンゼンプロトンに帰属されるシグナルを示した。このことから４、２′、３′、４′位に置換基を持つカルコン骨格をもつ化合物であることが示唆された。さらに１．４４（ｓ）、１．６０（ｓ）、１、６７（２Ｈ、ｍ）、２．１２（２Ｈ、ｄｄ）、５．０３（１Ｈ、ｔ）よりジメチルアリル基の存在が示唆された。以上のデータに加え1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータのドルスマニンＡ（Ｎｇａｄｉｕｉら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８巻、３４９頁、１９９８年）との比較により２′、３′位にピラン環が有る事が明らかになった。この構造の正しいことは1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及び、ＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００２８】
化合物３は高分解能ＥＩ−ＭＳ（［Ｍ+］ｍ／ｚ：４１０．２０９６）より分子式Ｃ25Ｈ30Ｏ5を持つことが示された。ＩＲスペクトルは水酸基、カルボニル基、芳香環の存在を示した。1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（δ（ｐｐｍ）、アセトン−ｄ6）は６．８７（２Ｈ、ｄ）、７．６７（２Ｈ、ｄ）よりパラ位に置換基を持つベンゼンプロトンのシグナルを示し、また、６．４５（１Ｈ、ｄ）、７．９１（１Ｈ、ｄ）に互いにオルト位に位置する２個のベンゼンプロトンに帰属されるシグナルを示した。このことから４、２′、３′、４′位に置換基を持つカルコン骨格をもつ化合物であることが示唆された。さらに１．１９（ｓ）、１．５０（２Ｈ、ｍ）、１．５７（ｓ）、１．６１（ｓ）、１．６５（２Ｈ、ｍ）、２．０８（２Ｈ、ｍ）、２．７１（２Ｈ、ｍ）、５．１０（１Ｈ、ｔｔ）より水酸基を持つゲラニル基の存在が示唆される。以上のデータに加え1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータのキサントアンゲロール（Ｂａｂａら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻、３９０７頁、１９９０年）との比較により３′位にゲラニル基が置換されていることが明らかになった。この構造の正しいことは1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及び、ＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００２９】
なお、化合物１〜１０は、上記のような化学構造式で示されるものであれば、アシタバから抽出した天然化合物に限られず、天然化合物を修飾し、或いは、化学合成することにより得るものであってもよい。
上述した本発明の化合物１〜１０は、単独であるいは混合して用いることができる。
また、化合物１〜１０は、適当な医薬用の担体又は希釈剤と組み合わせて医薬とすることができ、通常の如何なる方法によっても製剤化でき、経口又は非経口投与するための固体、半固体又は液体の剤形に処方することができる。処方にあたっては、他の医薬活性成分との配合剤としてもよい。
【００３０】
例えば、日本薬局方に記載されている各種製剤、即ち、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、乾燥エキス剤、トローチ剤等の内用固形製剤、流エキス剤、エリキシル剤、酒精剤、シロップ剤、リモナーデ剤等の内容液剤、チンキ剤、リニメント剤、ローション剤等の外用液剤、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤等の外用剤などに製剤化できる。また、投与可能であるならば、吸入剤、エアゾール剤、注射剤、点眼剤、座剤等にも用途に応じて製剤化してもよい。
【００３１】
経口投与においては、成人に対し体重１ｋｇ当り０．５〜５００ｍｇ／日の範囲で投与するのが好ましい。
また、本発明に係る化合物１〜１０は発癌予防の薬剤として使用するだけでなく、種々の飲食品に添加し、発癌予防に有効な機能性飲食品を製造するのにも有用なものである。このような機能性飲食品の形態の例としては、顆粒、錠菓、ゼリー、飴、飲料などが挙げられる。また、本発明に係る化合物１〜１０は、人間の食べる食品としてだけでなく、ペット、家畜、競技用動物などの人間以外の動物の飼料に添加して利用され得る。
【００３２】
［発癌予防効果の確認試験について］
次に、本発明の効果を確認するために行なった試験について説明する。
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）活性化抑制試験）
ＥＢＶ活性化抑制試験は、抗発癌プロモーター探索の一次スクリーニング法として知られた試験であり、迅速、かつ定量性に優れ、加えて、微量活性成分の検出が可能な点で優れた試験である。
【００３３】
まず、試験の手順について図１のスキームを参照しながら説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０巻、３０９頁、１９８８年）準拠している。
（１）１×１０6／ｍＬのＲａｊｉ（ラジ）細胞に、発癌プロモーターとして、２０ｎｇ／ｍＬの濃度の１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を３２ｐｍｏ１加え、さらにＴＰＡの活性発現のために相乗効果として働くｎ−酪酸を加えた。
（２）そこに、水、エタノール、又はジメチルスルホキシドに溶解した所定量の被験物質を添加して、３７℃で４８時間培養した。
（３）培養終了後、上咽頭癌患者の血清（ＴＰＡにより活性化された細胞由来の抗体を含む）を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ早期抗原の発現を検出した。
【００３４】
上記の手順にしたがって試験を行なった後、ＴＰＡのみを加えた群（コントロール）のＥＢＶ早期抗原の発現率を１００％として、被験物質添加物のＥＢＶ早期抗原の発現率を求め、次式（１）により被験物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を算出した。
ＥＢＶ早期抗原の発現阻害率
＝１００−被験物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率（％）…式（１）
【００３５】
検定は、前述のようにしてアシタバ浸出液から得られた化合物１〜１０を被験物質とし、各被験物質を種々の濃度（被験物質／ＴＰＡのモル比）に調製して行った。この検定の結果を表３に示す。また、参照化合物としてクルクミンを被験物質に用いた。
１０種のカルコン類、クマリン類、フラバノン類、及びジアセチレン類化合物のＥＢＶ発現阻害率（％）
【００３６】
【表３】
【００３７】
なお、被験物質の濃度が１０００倍モル濃度の欄の括弧内の数値は、ラジ細胞の生存率（％）を示す。この数値が高いほうが正常細胞に対する悪影響が小さい、すなわち安全性が高いといえる。表３に示されるように、アシタバ浸出液の成分は阻害率の高い化合物を有している。発癌予防効果があると知られている参照化合物のクルクミン（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５９巻、１３５頁、２０００年）と比較すると、化合物２、３、６〜９は１０００倍モル濃度ではクルクミンと同様に１００％の値を示し、１０倍モル濃度ではクルクミンよりも強い９〜１２％の値を示した。このことから抗発癌プロモーター活性に優れていることが確認された。更に、これらは本検定において高いラジ細胞生存率を示したことから、高い安全性を持つ発癌予防剤として期待できる。
【００３８】
さらに、化合物１〜１０をＮＯ障害に対する抑制試験を行い、活性を示したので説明する。
（ＮＯ障害に対する抑制試験）
（±）−（Ｅ）−４−メチル−２−［（Ｅ）−ハイドロキシイミノ］−５−ニトロ−６−メトキシ−３−ヘキセナミド（ＮＯＲ１）処理による細胞形態変化抑制試験は発癌イニシエターの一次スクリーニング法として知られた試験である。ＮＯはガス状のフリーラジカルであり、その過剰産生が慢性化すると、胃がんや大腸がんの危険性が高まるといわれている。このことから、ＮＯの過剰生産を抑制することが発癌予防に有効であるといえる。この試験は迅速、かつ微量活性成分の検出が可能な点で優れた試験である。
【００３９】
試験方法について説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０５巻、９頁、２００４年）に準拠している。
（１）イーグルの最小必要培地より得た５×１０5／ｍＬのヒト正常肝由来細胞を３日間培養する。
（２）そこに被験物質を加え、その１分後にＮＯドナーであるＮＯＲ１を加えＣＯ2インキュベーターで培養する。
（３）細胞の形態変化を光学顕微鏡にて測定する（２５０以上の形態変化を示した細胞数を測定する。）。
【００４０】
上記の手順に従って試験を行なった後、被験物質を加えない群をコントロールとし、次式によりＮＯ障害に対する抑制率を算出した。
ＮＯ障害に対する抑制率
＝ＮＯＲ１のみで形態変化した細胞（％）／ＮＯＲ１と被験物質を加えたときの形態変化した細胞（％）…式（２）
前述のようにアシタバ浸出液から得られた化合物１〜１０を被験物質として行った検定の結果を表４に示す。なお、参照化合物として、発癌予防効果があることが知られているクルクミン（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５９巻、１３５頁、２０００年）と、ＮＯスカベンジャーである２−（４−カルボキシフェニル）−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル３−オキシドナトリウム塩（カルボキシ−ＰＴＩＯ）を被験物質に用いた結果も示した。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４に示すように、化合物２、３、６、８、９は参照化合物と同程度、又はそれ以上の活性を示した。このことから抗発癌イニシエーター活性を有することが確認された。これらの化合物は発癌予防剤として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る化合物１〜１０の化学構造式を示す図である。
【図２】本発明に係る化合物２、３のＮＯＥＳＹスペクトル法により得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を説明する図である。
【図３】ＥＢＶ活性化抑制試験の手順を説明する図である。
【図４】ＮＯ障害に対する抑制試験の手順を説明する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドルスマンニンＡ、キサントアンゲロールＩ（ＩＵＰＡＣ名：２′，３′−［２−メチル−２−（４−メチル−３−ペンテニル）ピラノ］−４，４′−ジハイドロキシカルコン）、キサントアンゲロールＪ（ＩＵＰＡＣ名：２′，４，４′−トリヒドロキシ−３′−（３−ハイドロキシ−３，７−ジメチル−２−オクタエニル）カルコン）からなる群から選ばれた少なくとも１種のカルコン類化合物、キサントトキシン、イソピンピネリン、オスセノールからなる群から選ばれた少なくとも１種のクマリン類化合物、イソババチン、マンデレアフラバノンＢ、８−ゲラニルナリンゲニンからなる群から選ばれた少なくとも１種のフラバノン類化合物、及び、ジアセチレン類化合物である（１１Ｓ，１６Ｒ）−ジヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１７−ジエン−１２，１４−ジイン−１−イルアセタートのうちの少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする発癌予防剤。
【請求項２】
前記化合物は、アシタバを処理して得られることを特徴とする請求項１に記載の発癌予防剤。
【請求項１】
ドルスマンニンＡ、キサントアンゲロールＩ（ＩＵＰＡＣ名：２′，３′−［２−メチル−２−（４−メチル−３−ペンテニル）ピラノ］−４，４′−ジハイドロキシカルコン）、キサントアンゲロールＪ（ＩＵＰＡＣ名：２′，４，４′−トリヒドロキシ−３′−（３−ハイドロキシ−３，７−ジメチル−２−オクタエニル）カルコン）からなる群から選ばれた少なくとも１種のカルコン類化合物、キサントトキシン、イソピンピネリン、オスセノールからなる群から選ばれた少なくとも１種のクマリン類化合物、イソババチン、マンデレアフラバノンＢ、８−ゲラニルナリンゲニンからなる群から選ばれた少なくとも１種のフラバノン類化合物、及び、ジアセチレン類化合物である（１１Ｓ，１６Ｒ）−ジヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１７−ジエン−１２，１４−ジイン−１−イルアセタートのうちの少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする発癌予防剤。
【請求項２】
前記化合物は、アシタバを処理して得られることを特徴とする請求項１に記載の発癌予防剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１３１５９４（Ｐ２００６−１３１５９４Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２５３６９（Ｐ２００４−３２５３６９）
【出願日】平成１６年１１月９日（２００４．１１．９）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月９日（２００４．１１．９）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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